Năm Sasuke khoảng 9 tuổi và Itachi khoảng 14 tuổi, một biến cố lớn lao đã khiến cuộc đời hai anh em thay đổi vĩnh viễn - vụ thảm sát toàn bộ tộc Uchiha.

Itachi luôn mong muốn hòa bình nên cậu đã tiến đến quyết định khó khăn nhất là đồng ý với ý kiến những người lãnh đạo Làng Lá (nhất là Shimura Danzou): Hủy diệt gia tộc Uchiha, giải trừ mối nguy hiểm dẫn đến chiến tranh. Một mặt, cậu rất yêu thương gia đình và mong muốn điều tốt nhất cho họ, mặt khác, cậu biết con đường ít gây thương vong nhất để bảo vệ hòa bình làng Lá chính là tiêu diệt tộc Uchiha. Mặc dù Hokage đệ tam bảo Itachi hãy kéo dài thời gian để ông thương thuyết với gia tộc Uchiha, nhưng Danzou đã nhanh hơn ông một bước, dụ dỗ cậu đi theo con đường tiêu cực nhất bằng cách ép cậu chọn giữa tộc Uchiha và Sasuke. Theo Danzou giải thích, nếu cậu về phe gia tộc mình, nội chiến làng Lá sẽ xảy ra; còn nếu cậu đứng về phía làng và thay họ diệt trừ nhà Uchiha, em trai cậu sẽ sống sót. Vì vậy, bấy giờ Danzou chỉ cho Itachi hai lựa chọn: Tận diệt gia tộc rồi mang danh tội phạm cấp S, bù lại Sasuke được an toàn, hoặc dòng họ Uchiha sẽ phải chịu tiếng ô nhục và em trai cậu bị cuốn vào nội chiến. Trong suốt thời gian suy nghĩ để đi tới quyết định cuối cùng, Itachi vô cùng giằng xé và đau đớn. Đúng khoảng thời gian đó, Shisui đã giao cho Itachi một con mắt Sharingan (con mắt kia đã bị Danzou cướp mất) và nhờ đó cậu đạt đến cảnh giới tối cao của Sharingan, Mangekyo Sharingan. Sau khi tự móc mắt mình, Shisui nhảy xuống sông Nakano tự vẫn, trăn trối rằng Itachi hãy cố bảo vệ hòa bình và danh dự nhà Uchiha. Sau khi Shisui chết, Itachi ngày càng trở nên khép kín hơn và bắt đầu có biểu hiện chống đối gia tộc. Cậu không tham dự cuộc họp gia tộc, đánh lại các thành viên Uchiha và trở thành đối tượng tình nghi chính trong cái chết của Shisui.

Trước đêm thảm sát, Itachi bí mật đi gặp Uchiha Madara thực ra là Uchiha Obito ở mật thất nhà Uchiha, đề nghị ông ta hợp tác tiêu diệt gia tộc, với điều kiện Madara không được làm hại dân làng và Sasuke. Sau đó, cậu đã xuống tay tàn sát cả dòng họ mình, không chừa một ai. Trước khi Itachi giết cha mẹ, họ cũng hiểu và thông cảm cho con đường mà cậu chọn. Người cha Fugaku chỉ bắt cậu hứa rằng sẽ chăm lo cho Sasuke. Cậu đã nói "Con hứa" và bắt đầu khóc. Fugaku trăn trối trước khi chết: "Đừng sợ, đây là con đường mà con đã chọn, nỗi đau của chúng ta chỉ là thoảng qua, không kéo dài như con. Tuy lập trường khác nhau nhưng cha vẫn rất tự hào về con. Con thực sự là một đứa trẻ tốt". Itachi run rẩy cầm thanh kiếm vấy máu, nước mắt hòa với mồ hôi ướt đẫm khuôn mặt. Cậu đã giết cha mẹ và kịp lau nước mắt trước khi Sasuke bước vào. Trước sự đau khổ tột cùng của em trai, Itachi nói dối Sasuke rằng những kỉ niệm trước kia lẫn hình ảnh người anh tốt bụng chỉ là màn kịch Itachi dựng lên để thử xem năng lực Sasuke tới đâu thôi.

Itachi tha mạng cho Sasuke, kèm theo lời nói mà thằng nhóc không bao giờ quên được: "Thằng em ngu xuẩn, nếu muốn giết ta, hãy oán hận, hãy căm thù, trở nên mạnh mẽ hơn giữa thế giới xấu xa này. Chạy đi, chạy đi và cố mà sống sót! Chừng nào có được đôi mắt Sharingan như ta thì mới được tới tìm ta." Sau đó Itachi quay lưng bỏ đi, để lại Sasuke khóc ngất. Tuy vậy, Sasuke đã cố chạy theo, phóng phi tiêu vào Itachi, làm tuột dải băng trên đầu anh mình. Trong giây phút ngắn ngủi trước khi ngất xỉu vì kiệt sức, Sasuke tin rằng đã nhìn thấy cậu khóc.

Danzou và Itachi đã thỏa thuận với nhau, cậu sẽ gánh lấy tội giết Shisui để cướp đôi mắt, tội thảm sát gia tộc, tội phản bội làng và phải chịu truy nã toàn quốc. Hokage đệ tam đã giải thể đội ANBU Root - đội đặc nhiệm do Danzou trực tiếp chỉ huy, khi biết Danzou khơi màn cho Itachi thực hiện cuộc thảm sát (việc này được đề cập đến trong tập anime "Naruto Shippuden" 359). Itachi bí mật tới gặp Hokage đệ tam ngay sau cái đêm kinh hoàng ấy, xin ông bảo vệ Sasuke và đừng tiết lộ sự thật cho nó biết. Trước khi rời làng Lá, Itachi còn không quên đe dọa Danzou: "Nếu ông dám đụng tới một sợi tóc của Sasuke, ta sẽ tiết lộ hết bí mật đen tối của làng này cho các quốc gia đối địch khác, và ta sẽ tìm mọi cách xử tội ông." Tất cả những việc tàn bạo mà cậu làm với Sasuke từ trước đến nay, mục đích chỉ mong em trai trở thành một ninja mạnh mẽ, một ngày nào đó, nó sẽ có đủ khả năng đương đầu với cậu và giết chết cậu.